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    Isolement et caractérisation des bactéries dégradatrices de plastiques industriels
    (2021-01-20) ZERHOUNI Khadidja; Encadreur: ABBOUNI BOUZIANE
    Résumé (en Français) : Les matières plastiques, du fait de leur utilisation massive, constituent des polluants importants dans l’environnement. L’objectif de ce présent travail est l’isolement et la sélection des souches bactériennes productrices d'enzymes capables de dégrader le polyéthylène à basse densité. A cet effet, trois (03) échantillons de sol, contenant des sachets en plastique (polyéthylène à basse densité) décomposés, sont effectués à partir de différentes décharges publiques de la Wilaya de Tlemcen telles que la décharge de Nedroma, de Tlemcen ville nouvelle et ancienne décharge, de la région Ouest d'Algérie. Le screening primaire a permis l’isolement de 29 souches productrices d'enzymes capables de dégrader le PEBD. Ensuite, le screening secondaire a révélé la sélection de 11 souches (ML001, ML002, ML006, ML007, ML008, ML014, ML015, ML018, ML020, ML022 et ML029) productrices d'enzymes capables de dégrader le PEBD et ont fait l’objet d’une identification phénotypique. L’utilisation de l’outil de la biologie moléculaire a permis une identification génétique des souches sélectionnées productrices d'enzymes capables de dégrader le PEBD. En outre, l’analyse phylogénétique et le séquençage des souches isolées, sélectionnées productrices d'enzymes capables de dégrader le polyéthylène à basse densité, sont soumises et répertoriées dans la base des données GenBank. L’optimisation de différents paramètres impliqués dans la biodégradation par des souches sélectionnées a montré que les souches (ML007, ML014, ML020, ML022) ont manifesté une forte activité à une température comprise entre (30°C et 40°C). Cependant, les souches (ML001, ML018 etML029) ont montré une importante activité de dégradation de PEBD à des valeurs de pH (7, 9, 6) respectivement. Par ailleurs, la souche ML002 a manifesté une excellente activité dégradation de PEBD en présence d'une concentration de 4% NaCl. L’ajout du cuivre dans le milieu de culture inoculé avec des souches (ML001, ML002, ML006, ML007, ML008, ML014, ML015, ML018, ML020, ML022 et ML029) a amélioré considérablement l’activité de biodégradation du PEBD, accompagnée avec une perte de 2.05 % de poids pendant 30jours. Le séquençage des 11 souches sélectionnées dégradatrices du PEBD (ML001, ML002, ML006, ML007, ML008, ML014, ML015, ML018, ML020, ML022 et ML029) a révélé leur appartenance aux espèces : Bacillus subtilis ML636851, Bacillus thuringiensis MG738271, Lysinibacillus macroides ML636534, Bacillus subtilis ML636460 , Enterobacter cloacae ML636553, Bacillus cereus MT636856, Bacillus licheniformis MT636899, Rhodococcus gordoniae MT636651, Pseudomonas balearica MT636930, Pseudomonas aeruginosa MT636685, Staphylococcus pasteuri MT636753 respectivement, ce qui explique que les souches sélectionnées peuvent être excellents candidats dans la bioremédiation des sols pollués en plastique. Les mots clés : Biodégradation, Polyéthylène à basse densité, Bactéries productrices d'enzymes capables de dégrader le PEBD, Identification moléculaire. Abstract (en Anglais) : Plastics, due to their massive use, are important environmental pollutants. The objective of this work is the isolation, the selection of bacterial strains producing enzymes capable of degrading low density polyethylene. For this purpose, three (03) soil samples, containing decomposed plastic bags (low density polyethylene), are made from various public dumps of the Wilaya of Tlemcen such as the landfill of Nedroma, Tlemcen new and old city, of the Western region of Algeria. The primary screening allowed the isolation of 29 enzyme-producing strains capable of degrading LDPE. Then, the secondary screening revealed the selection of 11 strains (ML001, ML002, ML006, ML007, ML008, ML014, ML015, ML018, ML020, ML022 and ML029) producing enzymes capable of degrading the LDPE and were phenotypically identified. The use of the molecular biology tool has enabled genetic identification of selected enzyme-producing strains capable of degrading LDPE. In addition, phylogenetic analysis and sequencing of isolated strains, selected to produce enzymes capable of degrading low-density polyethylene. are submitted and listed in the Genbank database. Optimization of various parameters involved in biodegradation by selected strains showed that strains (ML007, ML014, ML020, ML022) showed high activity at a temperature between (30°C and 40°C). However, strains (ML001, ML018 and ML029) showed significant LDPE degradation activity at pH values (7, 9, 6) respectively. In addition, strain ML002 showed excellent LDPE degradation activity at a concentration of 4% Nacl. The addition of copper to the culture medium inoculated with strains (ML001, ML002, ML006, ML007, ML008, ML014, ML015, ML018, ML020, ML022 and ML029) significantly improved the biodegradation activity of the LDPE, accompanied by a loss of 2.05% of their weight. Sequencing of the 11 selected LDPE degrading strains (ML001, ML002, ML006, ML007, ML008, ML014, ML015, ML018, ML020, ML022 and ML029) revealed their species membership: Bacillus subtilis ML636851, Bacillus thuringiensis MG738271, Lysinibacillus macroides ML636534, Bacillus subtilis ML636460 , Enterobacter cloacae ML636553, Bacillus cereus MT636856, Bacillus licheniformis MT636899, Rhodococcus gordoniae MT636651, Pseudomonas balearica MT636930, Pseudomonas aeruginosa MT636685, Staphylococcus pasteuri MT636753 respectively, This explains why the strains selected can be excellent candidates in bioremediation of polluted plastic soils Keywords : Biodegradation, Low-density polyethylene,Enzyme-producing bacteria capable of degrading LDPE, Molecular identification.
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    Isolement et caractérisation des bactéries productrices de protéases à intérêt biotechnologique
    (2018-02-19) BOUKHTACHE HADJER; Encadreur: ABBOUNI BOUZIANE
    Résumé (Français et/ou Anglais) : RESUME Les producteurs d’enzymes ont effectué des recherches afin de trouver des alternatifs moins dispendieux en utilisant les sols riches en protéines comme substrat prometteur économique, afin de stimuler la production à des coûts moindres et valoriser les sous produit issu du sol. Dix (10) échantillons de sols riches en protéines où les déchets sont soumis à une fermentation naturelle, prélevés dans les environs de la ville de Chlef, en Algérie à partir des sols entourant, les laiteries, les abattoirs, les usines des alimentations de bétails et les sols riches en matières organiques en décomposition, ont fait l’objet d’une analyse microbiologique à fin de déterminer la diversité des bactéries productrices de la protéase. Le screening primaire a permis l’isolement de 115 souches protéolytiques, parmi lesquelles, 15 sont sélectionnées dans le screening secondaire comme les plus performantes et sont retenues pour être identifiées dans un premier temps par une caractérisation phénotypique, suivie d’une caractérisation génotypique par la technique de la PCR et le séquençage du gène codant l’ADNr 16S. L’utilisation de l’outil de la biologie moléculaire a permis une identification génétique des souches sélectionnées productrices de la protéase et l’analyse phylogénétique. Dans le but d’augmenter la production de la protéase chez les souches isolées sélectionnées, un certain nombre de paramètres tels que la source de carbone et d’azote, la température, le pH, le temps de réaction et la concentration en inoculum sont optimisés. Les résultats obtenus ont montré que chez les souches (T₂, T₂op, TB₂op, T₂', AH₂(-2), Xg₄, P₂op, E₃S₃P, H₁(-6), NB₁op,Y₄, LV₂, E₃S₄p, E₃S₁IBN et P₁op) une production maximale est obtenue après 48heures d’incubation lors de leurs inoculation sur un milieu de culture de production contenant : 1g/l glucose, 1g/l amidon, 1g/l caséine, 1% peptone et 2% d’inoculum avec des taux de production de (1,60, 1,45, 1,50, 1,80, 1,65, 1,30, 1,30, 1,70, 1,50, 1,65, 1,62, 0,95, 1,55, 1,48et 0,60 UI /ml) respectivement. L’activité protéolytique est mesurée et l’analyse de la pureté est ensuite effectuée par SDS-PAGE en conditions dénaturantes révélant l’apparence de bandes protéiques de poids moléculaires différents suggérant que ces enzymes sont homogènes, ce qui confirme que les souches isolées ont des activités protéolytiques différentes. Mots clés: Protéase, caractérisation, sols riche en protéines, le gène 16SrDNA, optimisation, SDS-PAGE. ABSTRACT Producers of enzymes are researching to find cheaper alternatives using protein rich soils as a promising economic substrate, to stimulate production at lower costs and to value the byproducts from soil. Ten (10) samples of protein rich soils where the waste is subjected to natural fermentation collected in the vicinity of the town of Chlef, Algeria from soils surrounding, dairies, slaughterhouses, cattle feeding factories and decomposing organic matter rich soils, were subjected to microbiological analysis in order to determine the diversity in protease producing bacteria. The primary screening allowed the isolation of 115 bacterial strains, from which 15 were selected in the secondary screening as the most powerful isolates and were chosen to be identified initially by a phenotypic characterization, followed by genotypic characterization by PCR and the sequencing of the gene encoding 16S rDNA. The use of molecular biology tool enabled a genetic identification and phylogenetic analysis of the selected strains producing proteases. In order to increase the production of proteases in selected high performance strains, a number of parameters such as carbon and nitrogen source, temperature, pH, reaction time and inoculums concentration have been optimized. The results obtained showed that maximum production (1,60, 1,45, 1,50, 1,80, 1,65, 1,30, 1,30, 1,70, 1,50, 1,65, 1,62, 0,95, 1,55, 1,48 and 0,60 UI /ml ) respectively for the strains (T₂, T₂op, TB₂op, T₂', AH₂(-2), Xg₄, P₂(op), E₃S₃P, H₁(-6), NB₁op, Y₄, LV₂, E₃S₄p, E₃S₁IBN and P₁op) is obtained after 48 hours of incubation during inoculation of the strains on a production medium containing, 1 g/l glucose, 1g/l starch, 1g/l casein, 1% peptone and 2% of inoculum. The proteolytic activity is measured and the purity analysis is then carried out by SDS-PAGE under denaturing conditions revealing the appearance of protein bands of different molecular weights suggesting that these enzymes are homogeneous, confirming that our strains have different proteolytic activities. Key words: Protease, characterization, proteins rich soils, 16S rDNA gene, optimization, SDS- PAGE.
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    Isolement et caractérisation des microorganismes à intérêt biotechnologique de la région de Sidi Bel Abbes
    (2017-02-28) MEZOUARI SOUMIA; Encadreur: ABBOUNI BOUZIANE
    Résumé (Français et/ou Anglais) : Les cyanobactéries constituent un groupe de bactéries capables de produire une multitude de substances antibactériennes, algicides, antifongiques, antivirales. L’objectif de ce travail est l’isolement, la purification et l’identification des cyanobactéries de certains écosystèmes aquatiques de la wilaya de Sidi Bel Abbes. L’activité antagoniste des substances bioactives élaborées par les isolats de cyanobactéries est mise en évidence vis-à-vis de certaines souches pathogènes responsables d’infections nosocomiales par l'utilisation des germes témoins de l'activité antagoniste utilisés. Ce sont des bactéries à gram positif : Staphylococcus aureus ATCC 43300, Enterobacter aerogenes ATCC 35029 et des bactéries à gram négatif : Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus vulgaris ATCC 6896 et Klebsiella pneumonia ATCC 10031, les levures : Candida albicans ATCC 20408, et champignons filamenteux : Aspergilus niger ATCC 6275, Aspergilus flavus ATCC 10124. A cet effet, quatre solvants organiques sont utilisés pour l’extraction des agents bioactifs responsables d’activité antagonistes, le méthanol, l’éthanol, l’acétone et l’éther diéthylique. Le screening primaire a permis l'isolement de quatre souches appartenant aux Cyanobactéries, avec l'appartenance de 75% des souches isolées à la famille des Oscillatoriaceae. La mise en évidence de l’activité antagoniste des cyanobactéries isolées vis-à-vis des germes témoins responsables d’infections nosocomiales par la méthode de diffusion des puits a révélé que les extraits des cyanobactéries ont manifesté une activité inhibitrice de croissance des souches testées. L'utilisation des extraits méthanoliques, acétoniques d’Oscillatoria sp, l’extrait méthanolique d’A.spherica et lyngbya sp, et l’extrait acétonique de Phormidium sp a manifesté une excellente activité antagoniste vis-à-vis des germes témoins de cette activité. A l'opposé, la souche E.coli a présenté une forte résistance par rapport à la totalité des extraits des cyanobactéries isolées. Par ailleurs, l'étude de l’activité antagoniste des cyanobactéries vis-à-vis des champignons filamenteux : Aspergilus niger ATCC 6275, Aspergilus flavus ATCC 10124 a révélé que les substances extraites à partir des cultures de Lyngbya sp et Phormidium sp à l'aide d’éther diétylique ont manifesté une excellente activité. Par contre, les substances extraites d’Anabeana spherica ont manifesté une faible activité antagoniste vis-à-vis de souches fongiques pathogènes. La caractérisation des pigments photosyntetiques fluorescents qui peuvent être responsables de l’activité antagoniste d’Anabeana spherica, réalisée par la technique HPLC et HPLC-DAD a permis l'identification de 9 composés la chlorophylle, α-caroténe, β-caroténe, la luteine, l’astaxanthine, la violaxanthine, la Zeaxanythine, Neoxanthine et Canthaxanthine. Abstract: Cyanobacteria are a group of bacteria able of producing a variety of antibacterial substances, algaecides, antifungal and antiviral. The aim of this work is isolation, purification and identification of cyanobacteria from some aquatic ecosystems of wilaya of Sidi Bel Abbes, thereafter evaluation of the antagonistic activity of bioactive substance of cyanobacteria against pathogenic strains responsible for nosocomials infections, 10 test strains are used such as Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus vulgaris ATCC 6896, Klebsiella pneumonia ATCC 10031 and Gram-positive strains such as Staphylococcus aureus ATCC 43300, Enterobacter aerogenes ATCC 35029. The used yeast was Candida albicans ATCC 20408 and the investigated filamentous fungi’s were Aspergilus niger ATCC 6275, Aspergilus flavus ATCC 10124. For this purpose, four organic solvents are used for the extraction of bioactive agentsresponsible for antagonistic activity methanol, ethanol, acetone, diethyl ether, the antagonistic activity of cyanobacteria is evaluated buy the using agar well diffusion method, the obtaine result showed that the extracts of the cyanobacteria showed growth inhibitory activity against the strains tested. The used of methanol and acetone extract of Oscillatoria sp, methanol extract of A.spherica and lyngbya sp, and aceton extractof Phormidium sp yielded the highest antagonistic activity against pathogenic strains. In contrast, E.coli has manifested an important resistance against crude extract of cyanobacteria. For antifungal activity the result revealed that the substances extracted from the cultures of Lyngbya sp and Phormidium sp using diethyl ether showed excellent activity. Furthermore, substances extracted from Anabeana spherica showed low antagonist activity against pathogenic fungal strains. The characterization of bioactive compounds responsible for antibacterial and antifungal activity is assased buy HPLC and HPLC-DAD, the results obtained allowed the identification of 9 compounds: chlorophylle, α-carotene, β-carotene, lutein, astaxanthin, violaxanthin,Zeaxanythin, Neoxanthin and Canthaxanthin.